Zobrazenie zdroja stránky CB07

==Praktická ukážka tvorby stromov==
* V UCSC browseri mozeme ziskavat viacnasobne zarovnania jednotlivych genov (nukleotidy alebo proteiny). Nasledujuci postup nemusite robit, subor si stiahnite tu: http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb06/cb06-aln.fa
** UCSC browseri si pozrieme usek ludskeho genomu (verzia hg38) chr6:135,851,998-136,191,840 s genom PDE7B (phosphodiesterase 7B) [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg38&position=chr6%3A135851998-136191840]
** Na modrej liste zvolime Tools, Table browser. V nastaveniach tabuliek Group: Genes and Gene Predictions, Track: GENCODE v 32., zaklikneme Region: position, a Output fomat: CDS FASTA alignment a stlacime Get output
** Na dalsej obrazovke zaklikneme show nucleotides, zvolime MAF table multiz100way a vyberieme si, ktore organizmy chceme. V nasom pripade z primatov zvolime chimp, rhesus, bushbaby, z inych cicavcov mouse, rat, rabbit, pig, cow, dog, elephant a z dalsich organizmov opposum, platypus, chicken, stlacime Get output.
** Vystup ulozime do suboru, nechame si iba prvu formu genu (ENST00000308191.11_hg38), z mien sekvencii zmazeme spolocny zaciatok (ENST00000308191.11_hg38), pripadne celkovo prepiseme mena na anglicke nazvy

* Skusme zostavit strom na stranke http://www.ebi.ac.uk/Tools/phylogeny/clustalw2_phylogeny/
** Distance correction: ako na prednáške, z počtu pozorovaných mutácií na evolučný čas
** Exclude gaps: vynechať všetky stĺpce s pomlčkami
** Clustering method: UPGMA predpokladá molekulárne hodiny, spájanie susedov nie
** P.I.M. vypíš aj maticu  vzdialeností (% identity, pred korekciou)
** Vo vyslednom strome by sme mali zmenit zakorenenie, aby sme mali sliepku (chicken) ako outgroup

* Výsledky z programu http://www.phylogeny.fr/alacarte.cgi , ktorý podporuje aj bootstrap:
** [[Media:Cb06-aln.pdf|Vysledok s povodnym zakorenenim]]
** [[Media:Cb06-aln-root.pdf|Vysledok so spravnym zakorenenim]] (chicken = outgroup)


* "Spravny strom" [http://genome-euro.ucsc.edu/images/phylo/hg38_100way.png] v nastaveniach Conservation track-u v UCSC browseri (podla clanku Murphy WJ et al Resolution of the early placental mammal radiation using Bayesian phylogenetics. Science 2001 [http://www.sciencemag.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=11743200])
* Nas strom ma dost zlych hran: zle postavenie hlodavcov, ale aj slona a psa. Zle postavenie hlodavcov môže byť spôsobené [https://en.wikipedia.org/wiki/Long_branch_attraction long branch attraction].
* Ak chcete skusit zostavit aj zarovnania, treba zacat z nezarovnanych sekvencii: [http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb06/cb06-seq.fa]

Ďalšia zaujímavá webstránka s veľa nástrojmi https://usegalaxy.eu/
* na tvorbu stromov sa dá použiť IQ-TREE
** modely vid tu: https://github.com/Cibiv/IQ-TREE/wiki/Substitution-Models
** vysledok [[CB:phylo]]
* viewer napr. http://phylotree.hyphy.org/

==Gény, evolúcia a komparatívna genomika v UCSC genome browseri (cvičenie pri počítači)==

* Zobrazme si gén CLCA4 [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg38&position=chr1%3A86538658-86589173]
* Zapnite si štandardnú sadu track-ov
* Po kliknutí na gén si môžete prečítať o jeho funkcii, po kliknutí na ľavú lištu alebo na názov tracku v zozname na spodku stránky si môžete prečítať viac o tracku a meniť nastavenia
* V tracku RefSeq genes si všimnite, že v tejto databáze má tento gén dve formy zostrihu, jedna z nich sa považuje za nekódujúcu, pretína sa aj s necharakterizovanou nekódujúcou RNA na opačnom vlákne
** Track RefSeq a jeho subtrack RefSeq Curated treba zapnut na pack
* Nižšie vidíte track H3K27Ac Mark (Often Found Near Regulatory Elements) on 7 cell lines from ENCODE, kde bola táto histónová modifikácia v okolí génu detegovaná?
* Všimnite si aj track DNase I Hypersensitivity, ktorý zobrazuje otvorený chromatin, prístupný pre viazanie transkripčných faktorov. Všimnite si jeho súvis s H3K27Ac trackom
* Obidva tracky sú súčasťou tracku ENCODE regulation, v ktorom si môžete zapnúť aj ďalšie pod-tracky

* Vsimnime si track Vertebrate Multiz Alignment & Conservation (100 Species) 
** v spodnej casti tracku vidime zarovnania s roznymi inymi genomami
** v nastaveniach tracku zapnite Element Conservation (phastCons) na full a Conserved Elements na dense
** v tomto tracku vidíme PhyloP, co zobrazuje uroven konzerovanosti danej bazy len na zaklade jedneho stlpca zarovnania a dva vysledky z phyloHMM phastCons, ktory berie do uvahy aj okolite stlpce
* Konkretne cast Conserved elements zobrazuje konkretne useky, ktore su najvac konzervovane 
** Ak chceme zistit, kolko percent genomu tieto useky pokryvaju, ideme na modrej liste do casti Tools->Table browser, zvolime group Comparative genomics, track Conservation, table 100 Vert. El, region zvolime genome (v celom genome)  a stlacime tlacidlo Summary/statistics, dostaneme nieco taketo: 
<TABLE border=1>
<TR><TD>item count</TD><TD ALIGN=RIGHT>10,350,729</TD></TR>
<TR><TD>item bases</TD><TD ALIGN=RIGHT>162,179,256 (5.32%)</TD></TR>
<TR><TD>item total</TD><TD ALIGN=RIGHT>162,179,256 (5.32%)</TD></TR>
<TR><TD>smallest item</TD><TD ALIGN=RIGHT>1</TD></TR>
<TR><TD>average item</TD><TD ALIGN=RIGHT>16</TD></TR>
<TR><TD>biggest item</TD><TD ALIGN=RIGHT>3,732</TD></TR>
<TR><TD>smallest score</TD><TD ALIGN=RIGHT>186</TD></TR>
<TR><TD>average score</TD><TD ALIGN=RIGHT>333</TD></TR>
<TR><TD>biggest score</TD><TD ALIGN=RIGHT>1,000</TD></TR>
</TABLE>
** Ak by nas zaujimali iba velmi dlhe "conserved elements", v Table browser stlacime tlacidlo Filter a na dalsej obrazovke do policka Free-form query dame '''chromEnd-chromStart>=1500'''
** Potom mozeme skusit Summary/Statistics alebo vystup typu Hyperlinks to genome browser a Get output - dostaneme zoznam tychto elementov a kazdy si mozeme jednym klikom pozriet v browseri, napr. taketo
*** [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg38&position=chr1:50201403-50203312 lod=24051 at chr1:50201403-50203312]
*** [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg38&position=chr1:55663689-55667047 lod=1899 at chr1:55663689-55667047] atd

* Pozrime si teraz ten isty gen CLCA4 v starsej verzii genomu hg18 [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg18&position=chr1%3A86776929-86827444]
** V casti Genes and Gene Prediction Tracks zapnite track Pos Sel Genes, ktory obsahuje geny s '''pozitivnym vyberom''' (cervenou, pripadne slabsie fialovou a modrou)
** Ked kliknete na cerveny obdlznik pre tento gen, uvidite, v ktorych castiach fylogenetickeho stromu bol detegovany pozitivny vyber
** Po priblizeni do jedneho z exonov [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg18&position=chr1%3A86805823-86805917] vidite dosledky nesynonymnych mutacii

Poznamka: Existuju aj webservery na predikciu pozitivneho vyberu, napriklad tieto dva:
* [http://selecton.tau.ac.il/ Selecton], [http://www.tau.ac.il/~talp/publications/selecton2007.pdf clanok]
* [http://www.datamonkey.org/ Data monkey] [http://mbe.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/22/5/1208 clanok]
* Skusili sme na Selecton poslat CLCA4 zo 7 cicavcov, subor tu: [http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb07/clca4.mfa]
** vysledky [http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb07/clca4-selecton.html] a [http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb07/clca4-omega.txt] (metoda ale odporuca aspon 10 homologov)

==Objavenie génu HAR1 pomocou komparatívnej genomiky==
* {{cite journal |author=Pollard KS, Salama SR, Lambert N, ''et al.'' |title=An RNA gene expressed during cortical development evolved rapidly in humans |journal=Nature |volume=443 |issue=7108 |pages=167–72 |year=2006 |month=September |pmid=16915236 |doi=10.1038/nature05113 |url=}} [http://ribonode.ucsc.edu/Pubs/Pollard_etal06.pdf pdf]
* Zobrali všetky regióny dĺžky aspoň 100bp s > 96% podobnosťou medzi šimpanzom a myšou/potkanom (35,000)
* Porovnali s ostatnými cicavcami, zistili, ktoré majú veľa mutáci v človeku, ale málo inde (pravdepodobnostný model)
* 49 štatisticky významných regiónov, 96% nekódujúcich oblastiach
* Najvýznamnejší HAR1: 118nt, 18 substitúcii u človeka, očakávali by sme 0.27. Iba 2 zmeny medzi šimpanzom a sliepkou (310 miliónov rokov), ale nebol nájdený v rybách a žabe.
* Nezdá sa byť polymorfný u človeka
* Prekrývajúce sa RNA gény HAR1A a HAR1B
* HAR1A je exprimovaný v neokortexe u 7 a 9 týždenných embrií, neskôr aj v iných častiach mozgu (u človeka aj iných primátov)
* Všetky substitúcie v človeku A/T->C/G, stabilnejšia RNA štruktúra (ale tiež sú blízko k telomére, kde je viacej takýchto mutácii kvôli rekombinácii a biased gene conversion)
===Cvičenie pri počítači===
* Môžete si pozrieť tento region v browseri: [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg38&position=chr20%3A63102114-63102274 '''chr20:63102114-63102274''' (hg38)], pricom ak sa este priblizite, uvidite zarovnanie aj s bazami a mozete vidiet, ze vela zmien je specifickych pre cloveka

==Praktické príklady z predchádzajúcich cvičení==

* [[CB01#QUAST:_program_na_.C5.A1tatistiky_o_kvalite_poskladania_gen.C3.B3mu]] Quast +  Galaxy
* [[CB04#Pr.C3.ADklady_praktick.C3.BDch_programov]] lokálne vs globálne zarovnanie

==Hľadanie génov==
K hladaniu genov pozri aj prezentacie {{pdf|Cb-gene}}

===Hľadanie génov v prokaryotických genómoch===

* ORF: open reading frame, jednoduche hladanie
* ako najst zaciatok, ako rozlisit psedogeny a nahodne ORF-y
* samotrenujuce sa HMM, codon bias, GC%

E. coli http://nar.oxfordjournals.org/content/34/1/1.full
* Prvykrat sekvenovana a anotovana 1997
* Porovnanie s verziou 2005 (oprava sekvenovacích chýb aj chýb v anotácii)
** 682 zmien v start kodone
** 31 génov zrušených
** 48 nových génov
** Celkovo asi 4464 génov

Programy na anotovanie prokaryotických genómov
* ORFfinder at NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/]
* Glimmer at NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/glimmer_3.cgi]
* GeneMark at NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/genemark.cgi]
* tRNAscan-SE [http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/]

===Histónové modifikácie===
* A. Barski, S. Cuddapah, K. Cui, T. Roh, D. Schones, Z. Wang, G. Wei, I. Chepelev, K. Zhao (2007) High-Resolution Profiling of Histone Methylations in the Human Genome Cell, Volume 129, Issue 4, Pages 823-837 [http://www.columbia.edu/cu/biology/courses/w3034/LACpapers/barskiMethylSolexCell07.pdf pdf]

===Gény v ľudskom genóme===
* What is a gene, post-ENCODE? History and updated definition. Gerstein MB, Bruce C, Rozowsky JS, Zheng D, Du J, Korbel JO, Emanuelsson O, Zhang ZD, Weissman S, Snyder M.
* Most "dark matter" transcripts are associated with known genes. H Van Bakel, C Nislow, BJ Blencowe, TR Hughes - PLoS Biol, 2010 
* [http://hmg.oxfordjournals.org/content/19/R2/R162.abstract Transcribed dark matter: meaning or myth?] CP Ponting, TG Belgard - Human molecular genetics, 2010
* [http://www.nature.com/nature/journal/v489/n7414/full/nature11233.html Landscape of transcription in human cells]. Djebali et al (ENCODE), Nature 2012