1-BIN-301, 2-AIN-501 Methods in Bioinformatics, 2022/23

Introduction · Rules · Tasks and dates · Materials · Moodle · Discussion
Quizzes can be found in Moodle.
Homework assignments and journal club papers can be found in Tasks and dates.
Groups for journal club have each their own channel in MS Teams.


CB12: Rozdiel medzi revíziami

Z MBI
Prejsť na: navigácia, hľadanie
(Vytvorená stránka „=CB12= ==Zhrnutie semestra== * vid prezentacia k cviceniu ==Uvod do teorie grafov== * vid prezentacia k cviceniu ==Ukážka práce v Linuxe== ===Prvá časť - prípr...“)
 
(CB12)
 
Riadok 1: Riadok 1:
=CB12=
+
==Zhrnutie semestra a úvod do teórie grafov==
==Zhrnutie semestra==
+
* vid prezentacie k cviceniu
* vid prezentacia k cviceniu
+
  
==Uvod do teorie grafov==
+
==Uniprot==
* vid prezentacia k cviceniu
+
* Prehladnejsi pohlad na proteiny, vela linkov na ine databazy, cast vytvarana rucne
 +
** Pozrieme sa na známy koronavírusový proteín Spike
 +
** Nájdime ho na stránke http://www.uniprot.org/ pod názvom SPIKE_SARS2
 +
** Pozrime si podrobne jeho stránku, ktoré časti boli predpovedané bioinformatickými metódami z prednášky?
 +
** Všimnime si niektorú Pfam doménu a pozrime si jej stránku
 +
 
 +
==PSI BLAST==
 +
* Toto cvičenie je z časti inšpirované stránkou [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/FieldGuide/problem_set.html]
 +
* Budeme uvažovať vzdialene podobné enzýmy
 +
** Bis(5'-adenosyl)-triphosphatase ([http://www.uniprot.org/uniprot/P49789 Uniprot])
 +
** Galactose-1-phosphate uridylyltransferase (GALT/GAL7) ([http://www.uniprot.org/uniprot/P31764 Uniprot])
 +
** Ich domény patria v databáze Pfam do toho istého klanu
 +
* Skúsme nájsť túto podobnosť v BLASTe: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ v časti proteíny, zvoľme databázu Swissport, ako Query zadajme Accesion nášho proteínu P49789, spustime program PSI-BLAST
 +
* V prvom kole PSI-BLAST spúšťa bežný BLASTP
 +
* GAL gén (konkrétne GAL7_HAEIN, accession P31764) sa nachádza medzi výsledkami, ale má príliš vysokú E-value
 +
* Spustíme teraz druhú iteráciu PSI-BLAST, ktorá zostaví profil z proteínov s nízkou E-value v prvej iterácii
 +
* Aká je E-value nájdeného zarovnania?
 +
* Ak by výpočet dlho trval, výsledky sú tu: [http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb08/psi-blast1.html 1. kolo], [http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb08/psi-blast2.html 2. kolo]
 +
 
 +
==Sekvenovanie v UCSC genome browseri==
 +
* Vráťte sa na UCSC genome browser http://genome-euro.ucsc.edu/
 +
* Pozrieme si niekoľko vecí týkajúcich sa sekvenovania a skladania genómov
 +
* Hore v modrom menu zvoľte Genomes, časť Other
 +
* Na ďalšej stránke zvoľte človeka a pomocou menu Human Assembly '''zistite, kedy boli pridané posledné dve verzie ľudského genómu (hg19 a hg38)'''
 +
* Na tej istej stránke dole nájdete stručný popis zvolenej verzie genómu. '''Pre ktoré oblasti genómu máme v hg38 najviac alternatívnych verzií? (haplotypes)'''
 +
* Prejdite na región chr21:31,250,000-31,300,000 v hg19  touto linkou: [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg19&position=chr21%3A31250000-31300000]
 +
* Zapnite si tracky Mapability a RepeatMasker na "full"
 +
* Mapability: nakoľko sa daný úsek opakuje v genóme a či teda vieme jednoznačne jeho čítania namapovať pri použití Next generation sequencing
 +
* Ako a prečo sa  pri rôznych dĺžkach čítaní líšia? (Keď kliknete na linku "Mapability", môžete si prečítať bližšie detaily.)
 +
* Približne v strede zobrazeného regiónu je pokles mapovateľnosti. '''Akému typu opakovania zodpovedá?''' (pozrite track RepeatMasker)
 +
* Zapnite si tracky "Assembly" a "Gaps" a pozrite si región chr2:110,000,000-110,300,000 v hg19: [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg19&position=chr2%3A110000000-110300000] '''Aká dlhá je neosekvenovaná medzera (gap) v strede tohto regiónu?''' Približnú veľkosť môžete odčítať z obrázku, presnejší údaj zistíte kliknutím na čierny obdĺžnik zodpovedajúci tejto medzere (úplne presná dĺžka aj tak nebola známa, nakoľko nebola osekvenovaná).
 +
* Cez menu položku View, In other genomes si pozrite, ako zobrazený úsek vyzerá vo verzii hg38. Ako sa zmenila dĺžka z pôvodných 300kb?
 +
* Prejdite na genóm Rhesus, verzia rheMac2, región chr7:59,022,000-59,024,000 [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=rheMac2&position=chr7%3A59022000-59024000], zapnite si tracky Contigs, Gaps, Quality scores
 +
* '''Aké typy problémov v kvalite sekvencie v tomto regióne vidíte?'''
 +
** Opäť si môžete pozrieť, či sa problémy odstránili a ako sa zmenila dĺžka sekvencie v najnovšej verzii rheMac8
 +
 
 +
==Gény, evolúcia a komparatívna genomika v UCSC genome browseri (cvičenie pri počítači)==
 +
 
 +
* Zobrazme si gén CLCA4 [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg38&position=chr1%3A86538658-86589173]
 +
* Zapnite si štandardnú sadu track-ov
 +
* Po kliknutí na gén si môžete prečítať o jeho funkcii, po kliknutí na ľavú lištu alebo na názov tracku v zozname na spodku stránky si môžete prečítať viac o tracku a meniť nastavenia
 +
* V tracku RefSeq genes si všimnite, že v tejto databáze má tento gén dve formy zostrihu, jedna z nich sa považuje za nekódujúcu, pretína sa aj s necharakterizovanou nekódujúcou RNA na opačnom vlákne
 +
** Track RefSeq a jeho subtrack RefSeq Curated treba zapnut na pack
 +
* Nižšie vidíte track H3K27Ac Mark (Often Found Near Regulatory Elements) on 7 cell lines from ENCODE, kde bola táto histónová modifikácia v okolí génu detegovaná?
 +
* Všimnite si aj track DNase I Hypersensitivity, ktorý zobrazuje otvorený chromatin, prístupný pre viazanie transkripčných faktorov. Všimnite si jeho súvis s H3K27Ac trackom
 +
* Obidva tracky sú súčasťou tracku ENCODE regulation, v ktorom si môžete zapnúť aj ďalšie pod-tracky
 +
 
 +
* Vsimnime si track Vertebrate Multiz Alignment & Conservation (100 Species)
 +
** v spodnej casti tracku vidime zarovnania s roznymi inymi genomami
 +
** v nastaveniach tracku zapnite Element Conservation (phastCons) na full a Conserved Elements na dense
 +
** v tomto tracku vidíme PhyloP, co zobrazuje uroven konzerovanosti danej bazy len na zaklade jedneho stlpca zarovnania a dva vysledky z phyloHMM phastCons, ktory berie do uvahy aj okolite stlpce
 +
* Konkretne cast Conserved elements zobrazuje konkretne useky, ktore su najvac konzervovane
 +
** Ak chceme zistit, kolko percent genomu tieto useky pokryvaju, ideme na modrej liste do casti Tools->Table browser, zvolime group Comparative genomics, track Conservation, table 100 Vert. El, region zvolime genome (v celom genome)  a stlacime tlacidlo Summary/statistics, dostaneme nieco taketo:
 +
<TABLE border=1>
 +
<TR><TD>item count</TD><TD ALIGN=RIGHT>10,350,729</TD></TR>
 +
<TR><TD>item bases</TD><TD ALIGN=RIGHT>162,179,256 (5.32%)</TD></TR>
 +
<TR><TD>item total</TD><TD ALIGN=RIGHT>162,179,256 (5.32%)</TD></TR>
 +
<TR><TD>smallest item</TD><TD ALIGN=RIGHT>1</TD></TR>
 +
<TR><TD>average item</TD><TD ALIGN=RIGHT>16</TD></TR>
 +
<TR><TD>biggest item</TD><TD ALIGN=RIGHT>3,732</TD></TR>
 +
<TR><TD>smallest score</TD><TD ALIGN=RIGHT>186</TD></TR>
 +
<TR><TD>average score</TD><TD ALIGN=RIGHT>333</TD></TR>
 +
<TR><TD>biggest score</TD><TD ALIGN=RIGHT>1,000</TD></TR>
 +
</TABLE>
 +
** Ak by nas zaujimali iba velmi dlhe "conserved elements", v Table browser stlacime tlacidlo Filter a na dalsej obrazovke do policka Free-form query dame '''chromEnd-chromStart>=1500'''
 +
** Potom mozeme skusit Summary/Statistics alebo vystup typu Hyperlinks to genome browser a Get output - dostaneme zoznam tychto elementov a kazdy si mozeme jednym klikom pozriet v browseri, napr. taketo
 +
*** [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg38&position=chr1:50201403-50203312 lod=24051 at chr1:50201403-50203312]
 +
*** [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg38&position=chr1:55663689-55667047 lod=1899 at chr1:55663689-55667047] atd
 +
 
 +
* Pozrime si teraz ten isty gen CLCA4 v starsej verzii genomu hg18 [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg18&position=chr1%3A86776929-86827444]
 +
** V casti Genes and Gene Prediction Tracks zapnite track Pos Sel Genes, ktory obsahuje geny s '''pozitivnym vyberom''' (cervenou, pripadne slabsie fialovou a modrou)
 +
** Ked kliknete na cerveny obdlznik pre tento gen, uvidite, v ktorych castiach fylogenetickeho stromu bol detegovany pozitivny vyber
 +
** Po priblizeni do jedneho z exonov [http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg18&position=chr1%3A86805823-86805917] vidite dosledky nesynonymnych mutacii
 +
 
 +
Poznamka: Existuju aj webservery na predikciu pozitivneho vyberu, napriklad tieto dva:
 +
* [http://selecton.tau.ac.il/ Selecton], [http://www.tau.ac.il/~talp/publications/selecton2007.pdf clanok]
 +
* [http://www.datamonkey.org/ Data monkey] [http://mbe.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/22/5/1208 clanok]
 +
* Skusili sme na Selecton poslat CLCA4 zo 7 cicavcov, subor tu: [http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb07/clca4.mfa]
 +
** vysledky [http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb07/clca4-selecton.html] a [http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb07/clca4-omega.txt] (metoda ale odporuca aspon 10 homologov)
  
 
==Ukážka práce v Linuxe==
 
==Ukážka práce v Linuxe==

Aktuálna revízia z 13:42, 10. december 2020

Zhrnutie semestra a úvod do teórie grafov

  • vid prezentacie k cviceniu

Uniprot

  • Prehladnejsi pohlad na proteiny, vela linkov na ine databazy, cast vytvarana rucne
    • Pozrieme sa na známy koronavírusový proteín Spike
    • Nájdime ho na stránke http://www.uniprot.org/ pod názvom SPIKE_SARS2
    • Pozrime si podrobne jeho stránku, ktoré časti boli predpovedané bioinformatickými metódami z prednášky?
    • Všimnime si niektorú Pfam doménu a pozrime si jej stránku

PSI BLAST

  • Toto cvičenie je z časti inšpirované stránkou [1]
  • Budeme uvažovať vzdialene podobné enzýmy
    • Bis(5'-adenosyl)-triphosphatase (Uniprot)
    • Galactose-1-phosphate uridylyltransferase (GALT/GAL7) (Uniprot)
    • Ich domény patria v databáze Pfam do toho istého klanu
  • Skúsme nájsť túto podobnosť v BLASTe: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ v časti proteíny, zvoľme databázu Swissport, ako Query zadajme Accesion nášho proteínu P49789, spustime program PSI-BLAST
  • V prvom kole PSI-BLAST spúšťa bežný BLASTP
  • GAL gén (konkrétne GAL7_HAEIN, accession P31764) sa nachádza medzi výsledkami, ale má príliš vysokú E-value
  • Spustíme teraz druhú iteráciu PSI-BLAST, ktorá zostaví profil z proteínov s nízkou E-value v prvej iterácii
  • Aká je E-value nájdeného zarovnania?
  • Ak by výpočet dlho trval, výsledky sú tu: 1. kolo, 2. kolo

Sekvenovanie v UCSC genome browseri

  • Vráťte sa na UCSC genome browser http://genome-euro.ucsc.edu/
  • Pozrieme si niekoľko vecí týkajúcich sa sekvenovania a skladania genómov
  • Hore v modrom menu zvoľte Genomes, časť Other
  • Na ďalšej stránke zvoľte človeka a pomocou menu Human Assembly zistite, kedy boli pridané posledné dve verzie ľudského genómu (hg19 a hg38)
  • Na tej istej stránke dole nájdete stručný popis zvolenej verzie genómu. Pre ktoré oblasti genómu máme v hg38 najviac alternatívnych verzií? (haplotypes)
  • Prejdite na región chr21:31,250,000-31,300,000 v hg19 touto linkou: [2]
  • Zapnite si tracky Mapability a RepeatMasker na "full"
  • Mapability: nakoľko sa daný úsek opakuje v genóme a či teda vieme jednoznačne jeho čítania namapovať pri použití Next generation sequencing
  • Ako a prečo sa pri rôznych dĺžkach čítaní líšia? (Keď kliknete na linku "Mapability", môžete si prečítať bližšie detaily.)
  • Približne v strede zobrazeného regiónu je pokles mapovateľnosti. Akému typu opakovania zodpovedá? (pozrite track RepeatMasker)
  • Zapnite si tracky "Assembly" a "Gaps" a pozrite si región chr2:110,000,000-110,300,000 v hg19: [3] Aká dlhá je neosekvenovaná medzera (gap) v strede tohto regiónu? Približnú veľkosť môžete odčítať z obrázku, presnejší údaj zistíte kliknutím na čierny obdĺžnik zodpovedajúci tejto medzere (úplne presná dĺžka aj tak nebola známa, nakoľko nebola osekvenovaná).
  • Cez menu položku View, In other genomes si pozrite, ako zobrazený úsek vyzerá vo verzii hg38. Ako sa zmenila dĺžka z pôvodných 300kb?
  • Prejdite na genóm Rhesus, verzia rheMac2, región chr7:59,022,000-59,024,000 [4], zapnite si tracky Contigs, Gaps, Quality scores
  • Aké typy problémov v kvalite sekvencie v tomto regióne vidíte?
    • Opäť si môžete pozrieť, či sa problémy odstránili a ako sa zmenila dĺžka sekvencie v najnovšej verzii rheMac8

Gény, evolúcia a komparatívna genomika v UCSC genome browseri (cvičenie pri počítači)

  • Zobrazme si gén CLCA4 [5]
  • Zapnite si štandardnú sadu track-ov
  • Po kliknutí na gén si môžete prečítať o jeho funkcii, po kliknutí na ľavú lištu alebo na názov tracku v zozname na spodku stránky si môžete prečítať viac o tracku a meniť nastavenia
  • V tracku RefSeq genes si všimnite, že v tejto databáze má tento gén dve formy zostrihu, jedna z nich sa považuje za nekódujúcu, pretína sa aj s necharakterizovanou nekódujúcou RNA na opačnom vlákne
    • Track RefSeq a jeho subtrack RefSeq Curated treba zapnut na pack
  • Nižšie vidíte track H3K27Ac Mark (Often Found Near Regulatory Elements) on 7 cell lines from ENCODE, kde bola táto histónová modifikácia v okolí génu detegovaná?
  • Všimnite si aj track DNase I Hypersensitivity, ktorý zobrazuje otvorený chromatin, prístupný pre viazanie transkripčných faktorov. Všimnite si jeho súvis s H3K27Ac trackom
  • Obidva tracky sú súčasťou tracku ENCODE regulation, v ktorom si môžete zapnúť aj ďalšie pod-tracky
  • Vsimnime si track Vertebrate Multiz Alignment & Conservation (100 Species)
    • v spodnej casti tracku vidime zarovnania s roznymi inymi genomami
    • v nastaveniach tracku zapnite Element Conservation (phastCons) na full a Conserved Elements na dense
    • v tomto tracku vidíme PhyloP, co zobrazuje uroven konzerovanosti danej bazy len na zaklade jedneho stlpca zarovnania a dva vysledky z phyloHMM phastCons, ktory berie do uvahy aj okolite stlpce
  • Konkretne cast Conserved elements zobrazuje konkretne useky, ktore su najvac konzervovane
    • Ak chceme zistit, kolko percent genomu tieto useky pokryvaju, ideme na modrej liste do casti Tools->Table browser, zvolime group Comparative genomics, track Conservation, table 100 Vert. El, region zvolime genome (v celom genome) a stlacime tlacidlo Summary/statistics, dostaneme nieco taketo:
item count10,350,729
item bases162,179,256 (5.32%)
item total162,179,256 (5.32%)
smallest item1
average item16
biggest item3,732
smallest score186
average score333
biggest score1,000
    • Ak by nas zaujimali iba velmi dlhe "conserved elements", v Table browser stlacime tlacidlo Filter a na dalsej obrazovke do policka Free-form query dame chromEnd-chromStart>=1500
    • Potom mozeme skusit Summary/Statistics alebo vystup typu Hyperlinks to genome browser a Get output - dostaneme zoznam tychto elementov a kazdy si mozeme jednym klikom pozriet v browseri, napr. taketo
  • Pozrime si teraz ten isty gen CLCA4 v starsej verzii genomu hg18 [6]
    • V casti Genes and Gene Prediction Tracks zapnite track Pos Sel Genes, ktory obsahuje geny s pozitivnym vyberom (cervenou, pripadne slabsie fialovou a modrou)
    • Ked kliknete na cerveny obdlznik pre tento gen, uvidite, v ktorych castiach fylogenetickeho stromu bol detegovany pozitivny vyber
    • Po priblizeni do jedneho z exonov [7] vidite dosledky nesynonymnych mutacii

Poznamka: Existuju aj webservery na predikciu pozitivneho vyberu, napriklad tieto dva:

Ukážka práce v Linuxe

Prvá časť - príprava

  • Prihláste sa na server podľa pokynov.
  • Potom spúšťajte jednotlivé príkazy podľa pokynov nižšie.
  • Odporúčame príkazy kopírovať myšou (v internetovom prehliadači vysvietiť, stlačiť Ctrl-C, v konzole Ctrl-Shift-V)


# riadky začínajúce mrežou # sú komentáre, netreba ich spúšťať

# Dôležité: v príkazoch nižšie xx nahraďte vašim číslom skupiny, napr. 01
mkdir xx
cd xx
# príkaz mkdir (make directory) vytvoril priečinok
# príkaz cd (change directory) zmenil váš aktuálny priečinok na tento nový

# v konzole by ste mali mať user@server:~/xx$
# kde xx je číslo vašej skupiny, napr. 01

# stiahneme si súbor s dátami zo stránky
wget http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb12.zip
# rozzipujeme ho
unzip cb12.zip

Druhá časť - skladanie genómov, mapovanie čítaní, zarovnanie

# prejdeme na priečinok s prvou časťou ohľadom sekvenovania
cd 1-seq

# ls vypíše zoznam súborov v priečinku
ls
# ls -l vypíše dlhšiu informáciu (long)
ls -l
# ls -lSh usporiada súbory podľa veľkosti (Size) a veľkosti vypíše priateľskejšie pre ľudí (human)
ls -lSh

# mali by sme vidieť kúsok sekvencie z E.coli (prípona .fasta)
# a 2 súbory zo sekvenovania prístrojom Illumina Miseq  (prípona .fastaq.gz)
# tieto súbory obsahujú čítania z vyššie uvedeného kúsku genómu


# ideme skladať genóm, bude to trvať dlho, preto to chceme spustiť na pozadí
# aby sme mohli medzitým robiť niečo iné
screen # stlačte Enter
# spustite skladanie programom spades
spades.py -t 1 -m 1 --pe1-1 miseq_R1.fastq.gz --pe1-2 miseq_R2.fastq.gz -o spades > spades.log
# stlačte naraz Ctrl-a potom d
# spades teraz beží na pozadí

# príkaz top zobrazí bežiace procesy
# ukončíte ho stlačením q (quit)
top

# príkaz less umožňuje prezerať si obsah textového súboru
# aj príkaz less ukončíte stlačením q, šípkami sa pohybujete po súbore
less ref.fasta
# čítania sú komprimované, preto namiesto less použijeme zless
zless miseq_R1.fastq.gz
# tieto príkazy spočítajú počet riadkov - ako z toho zistíme počet čítaní?
zcat miseq_R1.fastq.gz | wc -l 
zcat miseq_R2.fastq.gz | wc -l 

# keď spades skončí, vrátime sa do screen a ukončíme ho
screen -r
# exit ukončí screen
exit

# spades dal výstup do podpriečinku spades, pozrime si ho
ls spades
# skopírujeme si hlavný výsledok do nášho priečinka (cp = copy)
cp -ip spades/contigs.fasta spades.fasta
less spades.fasta
# pozrime si hlavičky jednotlivých sekvencií vo fasta súbore
grep '>' spades.fasta

# programom last si spravíme dotplot referencia vs. naše skladanie
# 1) vytvorenie indexu pre referenciu
lastdb ref.fasta ref.fasta 
# 2) samotné zarovnanie
lastal -f TAB ref.fasta spades.fasta > aln.tab
# 3) vytvorenie obrázku s dotplotom
last-dotplot aln.tab aln.png

# a ešte dotplot referencia vs. referencia
# 2) samotné zarovnanie (index už máme)
lastal -f TAB ref.fasta ref.fasta > aln2.tab
# 3) vytvorenie obrázku s dotplotom
last-dotplot aln2.tab aln2.png

# pozrieme si dotploty programom eog
eog aln.png &
eog aln2.png &


# zarovnajme čítania k referenčnému genómu v 4 krokoch
# 1) indexovanie fasta súboru
bwa index ref.fasta
# 2) samotné zarovnávanie čítaní programom bwa
bwa mem ref.fasta miseq_R1.fastq.gz miseq_R2.fastq.gz > ref-miseq.sam
# 3) zmeníme textový sam formát na binárny bam formát
samtools view -S -b ref-miseq.sam | samtools sort - ref-miseq
# 4) vytvoríme index bam súboru
samtools index ref-miseq.bam

# pozrime sa na zoznam súborov od najnovšieho po najstarší
ls -lth
# sam súbor so zarovnaniami sa dá pozrieť, ale nie je veľmi prehľadný
less ref-miseq.sam


# vytvoríme aj zarovnanie nášho poskladaného genómu k referencii vo formáte bam
samtools faidx ref.fasta
lastal ref.fasta spades.fasta -E1e-20 | maf-convert sam > ref-spades.sam
samtools view -S -b -t ref.fasta.fai ref-spades.sam | samtools sort - ref-spades
samtools index ref-spades.bam

# výsledky si zobrazíme v grafickom prehliadači igv 
# obdoba genome browsera, ktorú si môžete nainštalovať na vašom počítači
# POZOR: POTREBUJE VEĽA PAMÄTE, SPUSTÍME IBA JEDEN NARAZ
igv -g ref.fasta
# pomocou Menu->File->Load from File otvorte ref-spades.bam a ref-miseq.bam
# pozrime si región ecoli-frag:224,000-244,000
#   Vidíte jednotlivé kontigy? Sedí tento pohľad s dotplotom? 
# a potom bližšie ecoli-frag:227,300-227,600
#   Všimnite si sekvenačné chyby rozdiely medzi referenciou a kontigmi

Tretia časť - hľadanie génov, RNA-seq

# v druhom cvičení si vyskúšame hľadanie génov
# najskôr sa presuňme do druhého priečinku
cd ../2-genes

# pozrime si, aké máme súbory
ls -lSh
# mali by sme mať kúsok referenčného genómu huby Aspergillus nidulans 
# fastq súbor s čítaniami z RNA-seq pre tento kúsok referencie
# gff súbor s anotáciou génov z databázy

# spustíme hľadač génov Augustus 2x:
# raz s parametrami priamo pre A.nidulans a raz s parametrami pre ľudský genóm
augustus --species=anidulans ref2.fasta > augustus-anidulans.gtf
augustus --species=human ref2.fasta > augustus-human.gtf

# RNA-seq zarovnáme k sekvencii nástrojom tophat2 (podporuje intróny)
bowtie2-build ref2.fasta ref2.fasta
tophat2 -i 10 -I 10000 --max-multihits 1 --output-dir rnaseq ref2.fasta rnaseq.fastq
samtools sort rnaseq/accepted_hits.bam rnaseq
samtools index rnaseq.bam

# predikcie génov a RNA-seq si pozrieme v igv
igv -g ref2.fasta
# v igv si otvorte annot.gff, augustus-anidulans.gtf, augustus-human.gtf, rnaseq.bam
# - ktoré parametre Augustusu dali presnejšie predpovede (za predpokladu, že anotácia je správna)
# - pozrite si zblízka niektorý gén s vysokou expresiou (napr. druhy gen sprava), 
#   mali by ste vidieť čítania podporujúce intróny