CI-en-db

Úvod do bioinformatických databáz a on-line nástrojov

NCBI, Genbank, Pubmed, blast

• National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• Zhromazduje verejne pristupne data z molekularnej biologie
• Mozeme hladat klucove slova v roznych databazach
  • Pubmed: databaza clankov, napr. najdime phastcons
  • Gene: najdime DNA polymerazu
  • BLAST: najdime nasledujucu sekvenciu v genome kurata (zvoľme nucleotide blast, database others a z menu reference genomic sequence, organism chicken (taxid:9031), program blastn)
  • Ide o osekvenovany kusok ludskej mRNA, kde v kuracom genome sme nasli homolog, ake ma dlzku, skore, E-value, % zhodnych baz?

AACCATGGGTATATACGACTCACTATAGGGGGATATCAGCTGGGATGGCAAATAATGATTTTATTTTGAC
TGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAA
AGTTGGGCAGGTGTGTTTTTTGTCCTTCAGGTAGCCGAAGAGCATCTCCAGGCCCCCCTCCACCAGCTCC
GGCAGAGGCTTGGATAAAGGGTTGTGGGAAATGTGGAGCCCTTTGTCCATGGGATTCCAGGCGATCCTCA
CCAGTCTACACAGCAGGTGGAGTTCGCTCGGGAGGGTCTGGATGTCATTGTTGTTGAGGTTCAGCAGCTC
CAGGCTGGTGACCAGGCAAAGCGACCTCGGGAAGGAGTGGATGTTGTTGCCCTCTGCGATGAAGATCTGC
AGGCTGGCCAGGTGCTGGATGCTCTCAGCGATGTTTTCCAGGCGATTCGAGCCCACGTGCAAGAAAATCA
GTTCCTTCAGGGAGAACACACACATGGGGATGTGCGCGAAGAAGTTGTTGCTGAGGTTTAGCTTCCTCAG
TCTAGAGAGGTCGGCGAAGCATGCAGGGAGCTGGGACAGGCAGTTGTGCGACAAGCTCAGGACCTCCAGC
TTTCGGCACAAGCTCAGCTCGGCCGGCACCTCTGTCAGGCAGTTCATGTTGACAAACAGGACCTTGAGGC
ACTGTAGGAGGCTCACTTCTCTGGGCAGGCTCTTCAGGCGGTTCCCGCACAAGTTCAGGACCACGATCCG
GGTCAGTTTCCCCACCTCGGGGAGGGAGAACCCCGGAGCTGGTTGTGAGACAAATTGAGTTTCTGGACCC
CCGAAAAGCCCCCACAAAAAGCCG

Uniprot

• Prehladnejsi pohlad na proteiny, vela linkov na ine databazy, cast vytvarana rucne
  • Pozrieme sa na enzým Bis(5'-adenosyl)-triphosphatase
  • Nájdime ho na stránke http://www.uniprot.org/ pod názvom FHIT_HUMAN
  • Pozrime si podrobne jeho stránku, ktoré časti boli predpovedané bioinformatickými metódami z prednášky?
  • Všimnime si Pfam doménu a pozrime si jej stránku, do akej super-rodiny (klanu) patrí?

UCSC genome browser

• http://genome.ucsc.edu/

Sekvenovanie

• Hore v modrom menu zvoľte Genomes
• Na ďalšej stránke zvoľte človeka a v menu Assembly zistite, kedy boli pridané posledné dve verzie ľudského genómu (hg19 a hg38)
• Na tej istej stránke dole nájdete stručný popis zvolenej verzie genómu. Pre ktoré oblasti genómu máme v hg19 viacero alternatívnych verzií?
• Zadajte región chr21:31,200,000-31,350,000 v hg19
• Zapnite si tracky Mapability a RepeatMasker na "full"
• Mapability: nakoľko sa daný úsek opakuje v genóme a či teda vieme jednoznačne jeho ready namapovať pri použití Next generation sequencing
• Ako a prečo sa pri rôznych dĺžkach readov líšia? (Keď kliknete na linku "Mapability", môžete si prečítať bližšie detaily.)
• Približne v strede zobrazeného regiónu je pokles mapovateľnosti. Akému typu opakovania zodpovedá? (pozrite track RepeatMasker)
• Zapnite si tracky "Assembly" a "Gaps" a pozrite si región chr2:110,000,000-110,300,000. Aká dlhá je neosekvenovaná medzera (gap) v strede tohto regiónu? Približnú veľkosť môžete odčítať z obrázku, presnejší údaj zistíte kliknutím na čierny obdĺžnik zodpovedajúci tejto medzere (úplne presná dĺžka aj tak nebola známa, nakoľko nebola osekvenovaná).

Geny

• Zvolte starsiu verziu ludskeho genomu hg18, ktora ma viac informacii
• Do okienka position zadajte gen MAGEA2B a potom zvolte jeden jeho vyskyt (ma dva vyskyty)
  • Dostanete sa tam aj touto linkou: [1]
• Ak date 3x zoom out, mozete si vsimnut, ze tento gen ma viacero foriem zostrihu, ktore sa ale lisia iba v 5' UTR
• Vela veci sa mozete dozvediet klikanim na rozne casti broswera: napr, kliknutim na gen si mozete precitat o jeho funkcii, kliknutim na listu ku tracku (lavy okraj obazku) sa dozviete viac o tracku a mozete nastavovat parametre zobrazenia

Komparativna genomika

• V casti multiz alignments vidite zarovnania k roznym inym genomom (da sa zapinat, ze ku ktorym). Mozete si pozriet, ako sa uroven zarovnania zmeni ked sa priblizujeme a vzdalujeme (zoom in/zoom out).
• Ked sa priblizite spat na gen MAGEA2B a potom tak, aby ste boli na urovni "base", t.j. zobrazenych cca 100bp, v obdlzniku multiz alignment uvidite zarovnanie s homologickym usekom v inych genomoch. Konkretne v MAGEA2B vidime pomerne dost rozdielov v proteine medzi clovekom a makakom rezus, vdaka ktorym bol zrejme klasifikovany ako pod pozitivnym vyberom.
• V casti conservation by PhyloP vidime graf toho, ako silne su zachovane jednotlive stlpce zarovnania
• Da sa zapnut track Placental Chain/Net a pozriet sa na ktorych chromozomoch je ortologicky usek v inych genomoch

Blat

• Choďte na UCSC genome browser (http//genome.ucsc.edu/), na modrej lište zvoľte BLAT, zadajte DNA sekvenciu vyssie a hľadajte ju v ľudskom genóme. Akú podobnosť (IDENTITY) má najsilnejší nájdený výskyt? Aký dlhý úsek genómu zasahuje? (SPAN). Všimnite si, že ostatné výskyty sú oveľa kratšie.
• V stĺpci ACTIONS si pomocou Details môžete pozrieť detaily zarovnania a pomocou Browser si pozrieť príslušný úsek genómu.
• V tomto úseku genómu si zapnite track Vertebrate net na full a kliknutím na farebnú čiaru na obrázku pre tento track zistite, na ktorom chromozóme kuraťa sa vyskytuje homologický úsek.
• Skusme tu istu sekvenciu namapovat do genomu sliepky: stlacte najprv na hornej modrej liste Genomes, zvolte Vertebrates a Chicken a potom na hornej liste BLAT. Do okienka zadajte tu istu sekvenciu. Akú podobnosť a dĺžku má najsilnejší nájdený výskyt teraz? Na ktorom je chromozóme?
• Ako sa to porovna s hodnotami, ktore sme dostali pomocou BLASTu na NCBI?

Práca s tabuľkami, sťahovanie anotácií

• Položka Tables na hornej lište umožnuje robiť rafinované veci s tabuľkami, ktoré obsahujú súradnice génov a pod.
• Základná vec: vyexportovať napr. všetky gény v zobrazenom výseku v niektorom formáte:
  • sequence: fasta súbor proteínov, génov alebo mRNA s rôznymi nastaveniami
  • GTF: súradnice
  • Hyperlinks to genome browser: klikacia stránka
• Namiesto exportu si môžeme pozrieť rôzne štatistiky

• Zložitejšie: prienik dvoch tabuliek, napr. gény, ktoré sú viac než 50% pokryté simple repeats
  • V intersection zvolíme group: Variation and repeats, track: RepeatMasker, nastavíme records that have at least 50% overlap with RepeatMasker
  • V summary/statistics zistíme, kolko ich je v genóme, môžeme si ich preklikať cez Hyperlinks to genome browser

• Filter na tabuľku, napr. gény, ktoré majú v názve ribosomal (postup pre drozofilu):
  • V casti hg19.kgXref based filters políčko description dáme *ribosomal*

Fylogeneticke stromy, mobyle portal

• V UCSC browseri mozeme ziskavat viacnasobne zarovnania jednotlivych genov (nukleotidy alebo proteiny). Nasledujuci postup nemusite robit, subor si stiahnite tu: http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb06/cb06-aln.fa
  • UCSC browseri si pozrieme usek ludskeho genomu chr6:136,214,527-136,558,402 s genom PDE7B (phosphodiesterase 7B)
  • Na modrej liste zvolime Tables, v nej RefSeq genes, zaklikneme Region: position, a Output fomat: CDS FASTA alignment a stlacime Get output
  • Na dalsej obrazovke zaklikneme show nucleotides. Z primatov zvolime chimp, rhesus, tarsier, z inych cicavcov mouse, rat, dog, elephant a z dalsich organizmov opposum, platypus, chicken, lizard, stlacime Get output.
  • Vystup ulozime do suboru, z mien sekvencii zmazeme spolocny prefix NM_018945_, pripadne celkovo prepiseme mena na anglicke nazvy

• Skusme zostavit strom na stranke http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py
• Pouzijeme program quicktree, metodu neighbor joining, bootstrap 100
• Na zobrazenie stromu vysledok dalej prezenieme cez zobrazovacie programy drawtree alebo newicktops (zvolit v menu pri tlacidle further analysis)
  • Vysledok z drawtree, nezakoreneny, nezobrazuje bootstrap hodnoty
  • Vysledok z newicktops, zakoreneny na nahodnom mieste (nie spravne) zobrazuje bootstrap hodnoty
  • v drawtree sme nastavili sme formát výstupu MS-Windows Bitmap a X,Y resolution aspoň 1000, v newicktops sme nastavili show bootstrap values
• "Spravny strom" [2] v nastaveniach Conservation track-u v UCSC browseri (podla clanku Murphy WJ, Eizirik E, O'Brien SJ, Madsen O, Scally M, Douady CJ, Teeling E, Ryder OA, Stanhope MJ, de Jong WW, Springer MS. Resolution of the early placental mammal radiation using Bayesian phylogenetics. Science. 2001 Dec 14;294(5550):2348-51.)
• Nas strom ma long branch attraction (zle postavenie hlodavcov, ktori maju dlhu vetvu aj slona, co moze byt zapricene sekvenovacimi chybami).
• Ine programy, ktore mozete skusit na mobyle
  • phyml: metoda maximalnej vierohodnosti (daju sa nastavit detaily modelu, bootstraps, ktory ale moze dost dlho trvat, typy operacii na strome pri heuristickom hladani najlepsieho stromu)
  • dnapars alebo protpars na parsimony
  • viacnasobne zarovnanie pomocou clustalw alebo modernejsou alternativou muscle
  • Ak chcete skusat zarovnania, zacnite z nezarovnanych sekvencii: http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb06/cb06-seq.fa