CB12: Rozdiel medzi revíziami

Verzia zo dňa a času 13:42, 10. december 2020

Zhrnutie semestra a úvod do teórie grafov

• vid prezentacie k cviceniu

Uniprot

• Prehladnejsi pohlad na proteiny, vela linkov na ine databazy, cast vytvarana rucne
  • Pozrieme sa na známy koronavírusový proteín Spike
  • Nájdime ho na stránke http://www.uniprot.org/ pod názvom SPIKE_SARS2
  • Pozrime si podrobne jeho stránku, ktoré časti boli predpovedané bioinformatickými metódami z prednášky?
  • Všimnime si niektorú Pfam doménu a pozrime si jej stránku

PSI BLAST

• Toto cvičenie je z časti inšpirované stránkou [1]
• Budeme uvažovať vzdialene podobné enzýmy
  • Bis(5'-adenosyl)-triphosphatase (Uniprot)
  • Galactose-1-phosphate uridylyltransferase (GALT/GAL7) (Uniprot)
  • Ich domény patria v databáze Pfam do toho istého klanu
• Skúsme nájsť túto podobnosť v BLASTe: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ v časti proteíny, zvoľme databázu Swissport, ako Query zadajme Accesion nášho proteínu P49789, spustime program PSI-BLAST
• V prvom kole PSI-BLAST spúšťa bežný BLASTP
• GAL gén (konkrétne GAL7_HAEIN, accession P31764) sa nachádza medzi výsledkami, ale má príliš vysokú E-value
• Spustíme teraz druhú iteráciu PSI-BLAST, ktorá zostaví profil z proteínov s nízkou E-value v prvej iterácii
• Aká je E-value nájdeného zarovnania?
• Ak by výpočet dlho trval, výsledky sú tu: 1. kolo, 2. kolo

Sekvenovanie v UCSC genome browseri

• Vráťte sa na UCSC genome browser http://genome-euro.ucsc.edu/
• Pozrieme si niekoľko vecí týkajúcich sa sekvenovania a skladania genómov
• Hore v modrom menu zvoľte Genomes, časť Other
• Na ďalšej stránke zvoľte človeka a pomocou menu Human Assembly zistite, kedy boli pridané posledné dve verzie ľudského genómu (hg19 a hg38)
• Na tej istej stránke dole nájdete stručný popis zvolenej verzie genómu. Pre ktoré oblasti genómu máme v hg38 najviac alternatívnych verzií? (haplotypes)
• Prejdite na región chr21:31,250,000-31,300,000 v hg19 touto linkou: [2]
• Zapnite si tracky Mapability a RepeatMasker na "full"
• Mapability: nakoľko sa daný úsek opakuje v genóme a či teda vieme jednoznačne jeho čítania namapovať pri použití Next generation sequencing
• Ako a prečo sa pri rôznych dĺžkach čítaní líšia? (Keď kliknete na linku "Mapability", môžete si prečítať bližšie detaily.)
• Približne v strede zobrazeného regiónu je pokles mapovateľnosti. Akému typu opakovania zodpovedá? (pozrite track RepeatMasker)
• Zapnite si tracky "Assembly" a "Gaps" a pozrite si región chr2:110,000,000-110,300,000 v hg19: [3] Aká dlhá je neosekvenovaná medzera (gap) v strede tohto regiónu? Približnú veľkosť môžete odčítať z obrázku, presnejší údaj zistíte kliknutím na čierny obdĺžnik zodpovedajúci tejto medzere (úplne presná dĺžka aj tak nebola známa, nakoľko nebola osekvenovaná).
• Cez menu položku View, In other genomes si pozrite, ako zobrazený úsek vyzerá vo verzii hg38. Ako sa zmenila dĺžka z pôvodných 300kb?
• Prejdite na genóm Rhesus, verzia rheMac2, región chr7:59,022,000-59,024,000 [4], zapnite si tracky Contigs, Gaps, Quality scores
• Aké typy problémov v kvalite sekvencie v tomto regióne vidíte?
  • Opäť si môžete pozrieť, či sa problémy odstránili a ako sa zmenila dĺžka sekvencie v najnovšej verzii rheMac8

Gény, evolúcia a komparatívna genomika v UCSC genome browseri (cvičenie pri počítači)

• Zobrazme si gén CLCA4 [5]
• Zapnite si štandardnú sadu track-ov
• Po kliknutí na gén si môžete prečítať o jeho funkcii, po kliknutí na ľavú lištu alebo na názov tracku v zozname na spodku stránky si môžete prečítať viac o tracku a meniť nastavenia
• V tracku RefSeq genes si všimnite, že v tejto databáze má tento gén dve formy zostrihu, jedna z nich sa považuje za nekódujúcu, pretína sa aj s necharakterizovanou nekódujúcou RNA na opačnom vlákne
  • Track RefSeq a jeho subtrack RefSeq Curated treba zapnut na pack
• Nižšie vidíte track H3K27Ac Mark (Often Found Near Regulatory Elements) on 7 cell lines from ENCODE, kde bola táto histónová modifikácia v okolí génu detegovaná?
• Všimnite si aj track DNase I Hypersensitivity, ktorý zobrazuje otvorený chromatin, prístupný pre viazanie transkripčných faktorov. Všimnite si jeho súvis s H3K27Ac trackom
• Obidva tracky sú súčasťou tracku ENCODE regulation, v ktorom si môžete zapnúť aj ďalšie pod-tracky

• Vsimnime si track Vertebrate Multiz Alignment & Conservation (100 Species)
  • v spodnej casti tracku vidime zarovnania s roznymi inymi genomami
  • v nastaveniach tracku zapnite Element Conservation (phastCons) na full a Conserved Elements na dense
  • v tomto tracku vidíme PhyloP, co zobrazuje uroven konzerovanosti danej bazy len na zaklade jedneho stlpca zarovnania a dva vysledky z phyloHMM phastCons, ktory berie do uvahy aj okolite stlpce
• Konkretne cast Conserved elements zobrazuje konkretne useky, ktore su najvac konzervovane
  • Ak chceme zistit, kolko percent genomu tieto useky pokryvaju, ideme na modrej liste do casti Tools->Table browser, zvolime group Comparative genomics, track Conservation, table 100 Vert. El, region zvolime genome (v celom genome) a stlacime tlacidlo Summary/statistics, dostaneme nieco taketo:

• • Ak by nas zaujimali iba velmi dlhe "conserved elements", v Table browser stlacime tlacidlo Filter a na dalsej obrazovke do policka Free-form query dame chromEnd-chromStart>=1500
  • Potom mozeme skusit Summary/Statistics alebo vystup typu Hyperlinks to genome browser a Get output - dostaneme zoznam tychto elementov a kazdy si mozeme jednym klikom pozriet v browseri, napr. taketo
    • lod=24051 at chr1:50201403-50203312
    • lod=1899 at chr1:55663689-55667047 atd

• Pozrime si teraz ten isty gen CLCA4 v starsej verzii genomu hg18 [6]
  • V casti Genes and Gene Prediction Tracks zapnite track Pos Sel Genes, ktory obsahuje geny s pozitivnym vyberom (cervenou, pripadne slabsie fialovou a modrou)
  • Ked kliknete na cerveny obdlznik pre tento gen, uvidite, v ktorych castiach fylogenetickeho stromu bol detegovany pozitivny vyber
  • Po priblizeni do jedneho z exonov [7] vidite dosledky nesynonymnych mutacii

Poznamka: Existuju aj webservery na predikciu pozitivneho vyberu, napriklad tieto dva:

• Selecton, clanok
• Data monkey clanok
• Skusili sme na Selecton poslat CLCA4 zo 7 cicavcov, subor tu: [8]
  • vysledky [9] a [10] (metoda ale odporuca aspon 10 homologov)

Ukážka práce v Linuxe

Prvá časť - príprava

• Prihláste sa na server podľa pokynov.
• Potom spúšťajte jednotlivé príkazy podľa pokynov nižšie.
• Odporúčame príkazy kopírovať myšou (v internetovom prehliadači vysvietiť, stlačiť Ctrl-C, v konzole Ctrl-Shift-V)

# riadky začínajúce mrežou # sú komentáre, netreba ich spúšťať

# Dôležité: v príkazoch nižšie xx nahraďte vašim číslom skupiny, napr. 01
mkdir xx
cd xx
# príkaz mkdir (make directory) vytvoril priečinok
# príkaz cd (change directory) zmenil váš aktuálny priečinok na tento nový

# v konzole by ste mali mať user@server:~/xx$
# kde xx je číslo vašej skupiny, napr. 01

# stiahneme si súbor s dátami zo stránky
wget http://compbio.fmph.uniba.sk/vyuka/mbi-data/cb12.zip
# rozzipujeme ho
unzip cb12.zip

Druhá časť - skladanie genómov, mapovanie čítaní, zarovnanie

# prejdeme na priečinok s prvou časťou ohľadom sekvenovania
cd 1-seq

# ls vypíše zoznam súborov v priečinku
ls
# ls -l vypíše dlhšiu informáciu (long)
ls -l
# ls -lSh usporiada súbory podľa veľkosti (Size) a veľkosti vypíše priateľskejšie pre ľudí (human)
ls -lSh

# mali by sme vidieť kúsok sekvencie z E.coli (prípona .fasta)
# a 2 súbory zo sekvenovania prístrojom Illumina Miseq  (prípona .fastaq.gz)
# tieto súbory obsahujú čítania z vyššie uvedeného kúsku genómu


# ideme skladať genóm, bude to trvať dlho, preto to chceme spustiť na pozadí
# aby sme mohli medzitým robiť niečo iné
screen # stlačte Enter
# spustite skladanie programom spades
spades.py -t 1 -m 1 --pe1-1 miseq_R1.fastq.gz --pe1-2 miseq_R2.fastq.gz -o spades > spades.log
# stlačte naraz Ctrl-a potom d
# spades teraz beží na pozadí

# príkaz top zobrazí bežiace procesy
# ukončíte ho stlačením q (quit)
top

# príkaz less umožňuje prezerať si obsah textového súboru
# aj príkaz less ukončíte stlačením q, šípkami sa pohybujete po súbore
less ref.fasta
# čítania sú komprimované, preto namiesto less použijeme zless
zless miseq_R1.fastq.gz
# tieto príkazy spočítajú počet riadkov - ako z toho zistíme počet čítaní?
zcat miseq_R1.fastq.gz | wc -l 
zcat miseq_R2.fastq.gz | wc -l 

# keď spades skončí, vrátime sa do screen a ukončíme ho
screen -r
# exit ukončí screen
exit

# spades dal výstup do podpriečinku spades, pozrime si ho
ls spades
# skopírujeme si hlavný výsledok do nášho priečinka (cp = copy)
cp -ip spades/contigs.fasta spades.fasta
less spades.fasta
# pozrime si hlavičky jednotlivých sekvencií vo fasta súbore
grep '>' spades.fasta

# programom last si spravíme dotplot referencia vs. naše skladanie
# 1) vytvorenie indexu pre referenciu
lastdb ref.fasta ref.fasta 
# 2) samotné zarovnanie
lastal -f TAB ref.fasta spades.fasta > aln.tab
# 3) vytvorenie obrázku s dotplotom
last-dotplot aln.tab aln.png

# a ešte dotplot referencia vs. referencia
# 2) samotné zarovnanie (index už máme)
lastal -f TAB ref.fasta ref.fasta > aln2.tab
# 3) vytvorenie obrázku s dotplotom
last-dotplot aln2.tab aln2.png

# pozrieme si dotploty programom eog
eog aln.png &
eog aln2.png &


# zarovnajme čítania k referenčnému genómu v 4 krokoch
# 1) indexovanie fasta súboru
bwa index ref.fasta
# 2) samotné zarovnávanie čítaní programom bwa
bwa mem ref.fasta miseq_R1.fastq.gz miseq_R2.fastq.gz > ref-miseq.sam
# 3) zmeníme textový sam formát na binárny bam formát
samtools view -S -b ref-miseq.sam | samtools sort - ref-miseq
# 4) vytvoríme index bam súboru
samtools index ref-miseq.bam

# pozrime sa na zoznam súborov od najnovšieho po najstarší
ls -lth
# sam súbor so zarovnaniami sa dá pozrieť, ale nie je veľmi prehľadný
less ref-miseq.sam


# vytvoríme aj zarovnanie nášho poskladaného genómu k referencii vo formáte bam
samtools faidx ref.fasta
lastal ref.fasta spades.fasta -E1e-20 | maf-convert sam > ref-spades.sam
samtools view -S -b -t ref.fasta.fai ref-spades.sam | samtools sort - ref-spades
samtools index ref-spades.bam

# výsledky si zobrazíme v grafickom prehliadači igv 
# obdoba genome browsera, ktorú si môžete nainštalovať na vašom počítači
# POZOR: POTREBUJE VEĽA PAMÄTE, SPUSTÍME IBA JEDEN NARAZ
igv -g ref.fasta
# pomocou Menu->File->Load from File otvorte ref-spades.bam a ref-miseq.bam
# pozrime si región ecoli-frag:224,000-244,000
#   Vidíte jednotlivé kontigy? Sedí tento pohľad s dotplotom? 
# a potom bližšie ecoli-frag:227,300-227,600
#   Všimnite si sekvenačné chyby rozdiely medzi referenciou a kontigmi

Tretia časť - hľadanie génov, RNA-seq

# v druhom cvičení si vyskúšame hľadanie génov
# najskôr sa presuňme do druhého priečinku
cd ../2-genes

# pozrime si, aké máme súbory
ls -lSh
# mali by sme mať kúsok referenčného genómu huby Aspergillus nidulans 
# fastq súbor s čítaniami z RNA-seq pre tento kúsok referencie
# gff súbor s anotáciou génov z databázy

# spustíme hľadač génov Augustus 2x:
# raz s parametrami priamo pre A.nidulans a raz s parametrami pre ľudský genóm
augustus --species=anidulans ref2.fasta > augustus-anidulans.gtf
augustus --species=human ref2.fasta > augustus-human.gtf

# RNA-seq zarovnáme k sekvencii nástrojom tophat2 (podporuje intróny)
bowtie2-build ref2.fasta ref2.fasta
tophat2 -i 10 -I 10000 --max-multihits 1 --output-dir rnaseq ref2.fasta rnaseq.fastq
samtools sort rnaseq/accepted_hits.bam rnaseq
samtools index rnaseq.bam

# predikcie génov a RNA-seq si pozrieme v igv
igv -g ref2.fasta
# v igv si otvorte annot.gff, augustus-anidulans.gtf, augustus-human.gtf, rnaseq.bam
# - ktoré parametre Augustusu dali presnejšie predpovede (za predpokladu, že anotácia je správna)
# - pozrite si zblízka niektorý gén s vysokou expresiou (napr. druhy gen sprava), 
#   mali by ste vidieť čítania podporujúce intróny